Reducción de Nitratos a Nitritos
• Caldo nitrato
– Preparar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
– Repartir 1 mL por tubo.
– Autoclavar a 121 °C, 15 libras / pulg2, 15 minutos.
– Conservar los medios refrigerados a 4 – 10 °C
– Dimetil-a naftilamina 6 g
– Acido acético (5N), 30% 1000 mL
– Pasar la solución a un frasco volumétrico de 1 litro y completar a 1000 mL con el ácido acético 5N.
– Filtrar la solución.
– Guardar refrigerado (4 °C) en un frasco ámbar.
• Reactivo B
– Disolver el ácido sulfanílico en menos de 1000 mL de ácido acético 5N.
– Traspasar la solución a un frasco volumétrico de un litro y agregar ácido acético 5 N c.s.p 1000 mL y guardar refrigerado (4 °C) en un frasco ámbar.
– Ambos reactivos se mantienen estables por lo menos tres meses.
Interpretación Química y Bioquímica del Fundamento
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Primera Etapa: Adición de Reactivos A y B (Peter Griess)
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Reacción química: El Reactivo B (ácido sulfanílico) reacciona con el nitrito (NO₂⁻) formado en el medio para crear un sal de diazonio. Esta sal se acopla inmediatamente con el Reactivo A (α-naftilamina o dimetil-α-naftilamina), formando un azocompuesto de color rojo-grosella.
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Resultado Positivo para NO₃⁻ → NO₂⁻: Si al agregar los reactivos A y B el medio cambia a rojo, confirma que la bacteria posee la enzima nitrato reductasa y que la reducción se detuvo en la etapa de nitrito. El cambio a un color rojo dentro de 30 – 60 segundos
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Resultado "Sin cambio de color" (Incierto): Puede responder a dos escenarios opuestos:
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Falso negativo aparente: La bacteria redujo el nitrato a nitrito, pero continuó metabolizándolo rápidamente hacia nitrógeno gas (N₂) o amonio (NH₄⁺) (desnitrificación completa). Ya no queda nitrito libre en el medio para reaccionar con el reactivo de Griess.
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Verdadero negativo: La bacteria carece de nitrato reductasa y el nitrato (NO₃⁻) permanece intacto en el tubo.
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Segunda Etapa: Confirmación con 20 mg Polvo de Zinc El polvo de zinc actúa como un reductor químico inorgánico (no enzimático) que fuerza la reducción del nitrato (NO₃⁻) sobrante a nitrito (NO₂⁻).
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Resultado Positivo Final (Ausencia de color):
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Razón: El zinc no encuentra nitrato en el medio porque la bacteria ya lo había metabolizado por completo hasta N₂ o NH₄⁺ durante el periodo de incubación.
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Interpretación: La bacteria es positiva para la reducción de nitratos (desnitrificante completa, NO₃⁻ → N₂ / NH₄⁺).
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Resultado Negativo Final (Aparición de color rojo/rosado):
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Razón: El zinc reduce químicamente el nitrato que la bacteria no pudo metabolizar. El nitrito recién formado por la acción del zinc reacciona con los reactivos A y B previamente añadidos, virando el medio a rojo.
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Interpretación: La bacteria es negativa para la reducción de nitratos (el organismo no alteró el nitrato original).
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pruebas bacteriológicas, cocos g+, reduccion de nitratos a nitritos
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